本發(fā)明涉及生物成像，具體為雙光子頻域熒光壽命成像的體外細(xì)胞微環(huán)境動態(tài)監(jiān)測方法。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞微環(huán)境變化是生物醫(yī)學(xué)研究中的重要觀測對象，實時監(jiān)測其動態(tài)變化對于研究細(xì)胞微環(huán)境變化及生物響應(yīng)機(jī)制具有重要意義。然而，傳統(tǒng)的神經(jīng)炎癥監(jiān)測方法存在一定局限性。例如，基于免疫熒光的固定組織成像無法實時獲取炎癥動態(tài)信息，電生理記錄雖可實現(xiàn)高時間分辨率監(jiān)測，但難以提供細(xì)胞和分子水平的炎癥特征。

2、熒光壽命成像(flim)是一種通過測量熒光分子壽命變化來反映微環(huán)境特性的成像技術(shù)，能夠避免傳統(tǒng)熒光強(qiáng)度成像易受探針濃度和光漂白影響的問題。雙光子熒光壽命成像(2p-flim)利用紅外飛秒激光激發(fā)，實現(xiàn)對活體組織的深層成像，并結(jié)合頻域調(diào)制技術(shù)，提高壽命信號的獲取效率。相比時域flim，頻域flim具備更高的信噪比和數(shù)據(jù)采集速度，特別適用于活體生物樣本的動態(tài)成像。體外三維細(xì)胞模型因其可控性和可操作性優(yōu)勢，可用于高分辨率體外樣本成像。

3、盡管雙光子熒光成像(tp-flim)和熒光壽命成像(flim)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，但現(xiàn)有方法在神經(jīng)炎癥的實時監(jiān)測方面仍存在以下局限性：1、依賴熒光強(qiáng)度或固定樣本，無法實時、無損分析活體細(xì)胞微環(huán)境；2、時域flim數(shù)據(jù)采集效率低，動態(tài)分辨率不足。3、現(xiàn)有成像系統(tǒng)對微弱熒光信號解析能力有限。

4、在現(xiàn)有技術(shù)中，已有多種基于雙光子熒光成像技術(shù)的生物醫(yī)學(xué)成像方法和設(shè)備。

5、專利cn105891170a活體動物雙光子激發(fā)延時檢測熒光成像分析方法及設(shè)備：該專利提出了一種利用紅光或近紅外脈沖激光雙光子激發(fā)體內(nèi)熒光納米探針發(fā)光，并通過延時檢測方式探測體內(nèi)受激發(fā)部位熒光的成像方法。該方法旨在提高成像深度，減少自發(fā)熒光與背景光的干擾，從而提高成像分析的可靠性。

6、專利cn104198458a一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)及其成像方法：該專利介紹了一種利用可調(diào)諧飛秒激光源，通過雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)，對生物組織進(jìn)行高分辨率成像的方法。該系統(tǒng)采用了特定的光學(xué)元件和濾波器，以實現(xiàn)對生物樣本的精確成像。

7、專利cn101254091a用二次諧波和雙光子激發(fā)熒光實現(xiàn)高空間分辨視網(wǎng)膜成像的方法：該專利將二次諧波成像、偏振敏感二次諧波成像以及雙光子激發(fā)熒光成像相結(jié)合，對視網(wǎng)膜進(jìn)行高空間分辨成像，以實現(xiàn)眼底疾病的早期診斷。該方法通過激光掃描共焦檢眼鏡與超短脈沖激光器相耦合，對視網(wǎng)膜重要功能細(xì)胞層進(jìn)行成像，獲取其功能信息。

8、然而，這些現(xiàn)有技術(shù)方案主要關(guān)注于一般的生物組織成像或特定組織(如視網(wǎng)膜)的成像，尚未專門針對細(xì)胞微環(huán)境的動態(tài)監(jiān)測。此外，現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于雙光子熒光壽命成像的專利，多數(shù)采用時域檢測方法，而非頻域檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，提供雙光子頻域熒光壽命成像的體外細(xì)胞微環(huán)境動態(tài)監(jiān)測方法，能夠在亞細(xì)胞尺度上無損、實時地觀察神經(jīng)炎癥反應(yīng)，具備提高熒光強(qiáng)度成像精確定量分析的優(yōu)點(diǎn)。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出雙光子頻域熒光壽命成像的體外細(xì)胞微環(huán)境動態(tài)監(jiān)測方法，包括以下步驟：

3、s1、利用雙光子頻域熒光壽命成像tp-fd-flim技術(shù)，并通過熒光壽命參數(shù)無損表征微環(huán)境變化，實時監(jiān)測氧化應(yīng)激反應(yīng)及中性粒細(xì)胞遷移行為，結(jié)合體外細(xì)胞模型關(guān)聯(lián)化合物效應(yīng)分析；

4、s2、基于fd-flim的物理基礎(chǔ)建立于周期性激發(fā)下的頻域熒光壽命信號處理與分析系統(tǒng)，分析熒光信號相對激發(fā)光的相位延遲φ與調(diào)制深度m動態(tài)關(guān)聯(lián)特性，對分子壽命參數(shù)的定量反推。

5、優(yōu)選的，采用雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行雙光子頻域熒光壽命成像，成像過程為使用可調(diào)諧飛秒脈沖激光器生成激光，經(jīng)半波片hwp和偏振分束器pbs調(diào)控功率后，通過4f系統(tǒng)準(zhǔn)直擴(kuò)束，并由二維檢流計振鏡控制xy掃描，激發(fā)光經(jīng)高數(shù)值孔徑物鏡聚焦至樣品，雙光子熒光信號經(jīng)濾波后由光電倍增管pmt探測，以實現(xiàn)高時空分辨率的熒光壽命成像。

6、優(yōu)選的，建立于周期性激發(fā)下的頻域熒光壽命信號處理與分析系統(tǒng)包括四相位正交混頻器、移相補(bǔ)償模塊及相量分析算法。

7、優(yōu)選的，s1中，通過熒光壽命參數(shù)無損表征微環(huán)境變化，實時監(jiān)測氧化應(yīng)激反應(yīng)及中性粒細(xì)胞遷移行為，結(jié)合體外細(xì)胞模型關(guān)聯(lián)化合物效應(yīng)分析的具體步驟為：

8、s11、監(jiān)測熒光壽命表征代謝狀態(tài)：測量內(nèi)源性熒光分子的壽命變化，計算代謝指標(biāo)間接反映的nad+/nadh的比值，推導(dǎo)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)及代謝水平；

9、s12、獲取氧化應(yīng)激的熒光壽命信號：獲取活性氧ros積累程度，活性氧ros的積累程度表現(xiàn)為熒光壽命縮短；

10、s13、進(jìn)行炎癥相關(guān)細(xì)胞追蹤：通過egfp標(biāo)記中性粒細(xì)胞，結(jié)合壽命信號分析炎癥相關(guān)細(xì)胞在炎癥區(qū)域的募集與遷移特征。

11、優(yōu)選的，s2中，建立于周期性激發(fā)下的頻域熒光壽命信號處理與分析系統(tǒng)，頻域熒光壽命信號處理的步驟包括：

12、s211、信號預(yù)處理：數(shù)據(jù)采集卡daq采集同步信號，采用激光器輸出同步參考信號，由低通濾波lpf抑制高次諧波后，并由低噪聲放大器lna提升信噪比；

13、s212、信號分配與相位調(diào)控：預(yù)處理后的信號由四路功率分配器生成四路同源信號，并通過移相器phase?shifter進(jìn)行0～2π的相位調(diào)控；

14、s213、信號放大與混頻：調(diào)整后的信號經(jīng)lna放大后輸入混頻器mixer，與來自光電倍增管pmt的熒光信號進(jìn)行混頻，形成四路正交參考信號；

15、s214、pmt信號處理與解調(diào)：pmt輸出的微弱電流信號首先經(jīng)過跨阻放大器轉(zhuǎn)換為電壓信號，進(jìn)行電流分離和濾波處理，以去除噪聲和干擾；處理后的pmt信號與四路正交參考信號進(jìn)行混頻解調(diào)，提取出與熒光壽命相關(guān)的特征信息；

16、s215、信號解析與校準(zhǔn)：采用四相位矩陣運(yùn)算解析熒光信號，計算熒光壽命、相量坐標(biāo)及強(qiáng)度圖像的關(guān)鍵參數(shù)；采用全50ω阻抗匹配架構(gòu)并結(jié)合電磁屏蔽措施進(jìn)行阻抗匹配與電磁屏蔽，以優(yōu)化信噪比；采用動態(tài)校準(zhǔn)算法實時修正通道偏差，確保微弱熒光信號的準(zhǔn)確解析。

17、優(yōu)選的，s2中，分析熒光信號相對激發(fā)光的相位延遲φ與調(diào)制深度m動態(tài)關(guān)聯(lián)特性，對分子壽命參數(shù)的定量反推的步驟包括：

18、s221、利用周期性激發(fā)光的頻域特性解析熒光信號，激發(fā)函數(shù)建模，計算獲得熒光信號并分析熒光信號特性；

19、s222、解析頻域信號與假設(shè)模型：將周期性熒光信號f(t)分解為傅里葉級數(shù)，提取頻域響應(yīng)，其表達(dá)式為：

20、

21、式中，傅里葉級數(shù)qk由積分定義為

22、s223、相位延遲與調(diào)制深度測量：對光電倍增管pmt捕獲的熒光信號偏置三通進(jìn)行信號分離處理，將原始時域信號f(t)分解為直流dc和射頻rf分量，rf部分含壽命信息；采用射頻混頻技術(shù)提取基波特征，通過四通道功率分配架構(gòu)并行傳輸處理熒光信號與參考信號；

23、對光電倍增管pmt捕獲的熒光信號偏置三通進(jìn)行信號分離處理的具體處理過程為：

24、直流分量表征熒光信號的時間積分強(qiáng)度，對應(yīng)頻域傅里葉級數(shù)的基頻系數(shù)q0，數(shù)學(xué)表達(dá)為：

25、

26、式中，b為偏置三通的直流轉(zhuǎn)換效率，ob為系統(tǒng)固有直流偏移，q0為熒光信號的零階傅里葉系數(shù)，表征穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度，vdc為偏置器直流端口分量；

27、射頻rf分量對應(yīng)頻域傅里葉級數(shù)的基頻系數(shù)qk，數(shù)學(xué)表達(dá)表示為：

28、

29、或

30、式中，vrf為偏置器射頻端口分量；

31、s224、系統(tǒng)校準(zhǔn)與參數(shù)提?。航⒁葡嗥髌秒妷号c相位偏移量的映射關(guān)系，標(biāo)定混頻器損耗系數(shù)與增益系數(shù)，計算關(guān)鍵參數(shù)比值m/b，生成四組正交參考信號，校正通道增益差異；

32、s225、相量分析與壽命定量反推：分析四組正交相移信號，用矩陣運(yùn)算消除直流偏移量om，并通過與熒光的一次諧波傅里葉系數(shù)的虛部和實部存在正比關(guān)系提取熒光壽命；通過相量圖水平分量g和垂直分量s計算多指數(shù)衰減的平均壽命。

33、優(yōu)選的，s221利用周期性激發(fā)光的頻域特性解析熒光信號，激發(fā)函數(shù)建模，計算獲得熒光信號并分析熒光信號特性的具體步驟為對采用重復(fù)頻率80mhz的飛秒脈沖序列脈寬小于100fs的激發(fā)熒光分子的時域激發(fā)函數(shù)建模為狄拉克梳分布，表達(dá)式為：

34、i(t)＝pδt(t)；

35、式中，p是與激光束平均功率相關(guān)的系數(shù)，i(t)是激發(fā)光的時間分布函數(shù)，δt(t)是周期為t的狄拉克梳函數(shù)，表示周期性脈沖序列；

36、在雙光子激發(fā)過程中，熒光信號f(t)與激發(fā)光強(qiáng)平方及熒光團(tuán)的脈沖響應(yīng)函數(shù)f(t)的卷積成正比，熒光信號f(t)表達(dá)為：

37、

38、式中，c為熒光團(tuán)濃，為單指數(shù)衰減熒光團(tuán)的脈沖響應(yīng)函數(shù)，此處儀器響應(yīng)函數(shù)irf遠(yuǎn)低于熒光團(tuán)的壽命值，irf忽略不計。

39、優(yōu)選的，s222中，假設(shè)模型分為單組分模型和多組分模型，在單指數(shù)衰減熒光團(tuán)的脈沖響應(yīng)函數(shù)f(t)為：

40、

41、式中，τ表示熒光壽命，表示分子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的平均時間，反映其微環(huán)境的理化特性；

42、對于多組分熒光樣品通過測量相位差和調(diào)制比解析各組分壽命，脈沖響應(yīng)函數(shù)擴(kuò)展為：

43、

44、式中，ai為壽命τi的熒光團(tuán)的強(qiáng)度加權(quán)分?jǐn)?shù)貢獻(xiàn)，τi為多組分中不同的壽命為，多組分熒光樣品的傅里葉系數(shù)qk為：

45、優(yōu)選的，s223中，通過四通道功率分配架構(gòu)并行傳輸處理熒光信號與參考信號的具體步驟為：

46、s2231、在每條獨(dú)立通道內(nèi)設(shè)置電壓控制移相器預(yù)設(shè)相位偏移量，生成四路正交參考信號輸入混頻器本地振蕩端口lo，進(jìn)行四通道同步解調(diào)實現(xiàn)熒光信號的實時相位解析，其表達(dá)式為：

47、vlo(t,o)＝sin(ωt+φ)；

48、式中，νlo為lo端口的信號。

49、s2232、四個混頻器分別將pmt信號與移相后的參考信號接入各自的射頻rf和本振lo端口，在輸出信號中獲取固有直流偏移量，固有直流偏移量om表達(dá)式為：

50、om＝o(prf)+d；

51、式中，o(prf)是射頻功率的函數(shù)，d為系統(tǒng)固有常數(shù)偏移；

52、s2233、對混頻器輸出進(jìn)行修正，將混頻器輸出信號經(jīng)低通濾波處理，以消除所有高次諧波分量，將濾波后的信號轉(zhuǎn)換表現(xiàn)為純直流電壓，其中，混頻器輸出修正后的表達(dá)式為：

53、vif(t,φ)＝mvlo(t,φ)vrf(t)+om；

54、式中，m為混頻器的轉(zhuǎn)換損耗系數(shù)，if為中頻,νif為混頻器的輸出函數(shù)；

55、濾波后的信號轉(zhuǎn)換的純直流電壓的數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

56、

57、s2234、對熒光壽命計算所需的四路解調(diào)信號通過數(shù)據(jù)采集卡daq進(jìn)行同步采樣與數(shù)字化轉(zhuǎn)換。

58、優(yōu)選的，s225中，多指數(shù)衰減的平均壽命的計算公式為

59、因此，本發(fā)明提出了雙光子頻域熒光壽命成像的體外細(xì)胞微環(huán)境動態(tài)監(jiān)測方法，其有益效果如下：

60、(1)本發(fā)明提出的雙光子頻域熒光壽命成像的體外細(xì)胞微環(huán)境動態(tài)監(jiān)測方法，利用熒光壽命變化表征炎癥微環(huán)境的氧化還原狀態(tài)和代謝特征，可提供比傳統(tǒng)熒光強(qiáng)度成像更精確的定量分析，為細(xì)胞微環(huán)境動態(tài)監(jiān)測及生物響應(yīng)分析提供新工具，實現(xiàn)了細(xì)胞體外微環(huán)境樣本的實時、無損動態(tài)分析，避免傳統(tǒng)方法的侵入性與滯后性。

61、(2)本發(fā)明通過頻域信號處理提升熒光壽命檢測效率與信噪比。

62、(3)本發(fā)明構(gòu)建定量評估模型，解析細(xì)胞微環(huán)境氧化應(yīng)激及代謝特征。

63、下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。